細(xì)胞培養(yǎng)常用的消化液

一、胰蛋白酶（trypsin）溶液

    胰蛋白酶是白色或淡黃色粉末，低溫干燥保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性以其消化酪蛋白的能力進(jìn)行測(cè)定。常用1:250（1:500）方法表示，即1份胰蛋白酶可以消化250份（或500份）酪蛋白。

胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的性質(zhì)關(guān)系密切。不同細(xì)胞系對(duì)胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時(shí)間等的要求也不相同。

    無(wú)鈣鎂離子的平衡鹽溶液（常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗滌細(xì)胞）

    NaCl    8g

    KCl    0.20g

    KH2PO4    0.02g

    Na2HPO4    0.073g

    葡萄糖    2.00g

    酚紅    0.02g

    溶于1000ml水中

    染色體的G帶核型實(shí)驗(yàn)中胰蛋白酶用生理鹽水配制。

二、EDTA溶液

    又稱versene，一般用其鈉鹽，因可溶性較好。有些組織需要Ca2+、Mg2+來(lái)保持其完整性，用EDTA來(lái)排除這些離子，可使細(xì)胞之間裂解，以分散細(xì)胞。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無(wú)鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。

    實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用。可提高消化效率，細(xì)胞分散情況改善。

EDTA不能被血清抑制，所以消化后必須*清洗。

EDTA對(duì)成纖維細(xì)胞作用差。

三、膠原酶溶液

    1．用Hank's液配制成2000U/ml

    2．36.5度攪拌溶解1h，4度通宵

    3．濾過(guò)消毒

    4．分裝成等份使用（1-2周內(nèi)）

    5．長(zhǎng)時(shí)間貯存在-20度

四、貼壁細(xì)胞——消化法——細(xì)胞懸液

    1．吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液。

    2．以25cm2培養(yǎng)瓶為例，向瓶?jī)?nèi)加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液，輕輕搖動(dòng)后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。也可不采用上述步驟，直接加1-2ml消化液進(jìn)行消化，但要注意盡量減少消化液的剩余量，因?yàn)橄哼^(guò)多對(duì)細(xì)胞有損傷，同時(shí)也需要較多的含血清培養(yǎng)液去中和。

    3．消化在37度或室溫25度環(huán)境下進(jìn)行。消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

    4．如僅用胰蛋白酶可直接加含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

       如用EDTA消化，需加Hank's液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留EDTA消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液，這個(gè)操作過(guò)程要十分小心，如果細(xì)胞已經(jīng)脫壁則消化液不能夠倒掉，以免丟失細(xì)胞，要加入Hank's液或培養(yǎng)液終止消化，吹打收集細(xì)胞懸液，離心漂洗去除EDTA。

    5．用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過(guò)程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛，同時(shí)盡量不要出現(xiàn)泡沫，這些都對(duì)細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。

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